Химикам, биолухам, а особенно биохимикам

[murrka]

Проблема: неспецифичное связывание белка с отрезком ДНК.
Возможное решение: поменять буффер реакции (EMSA).
Из литературы выужено три буффера: X, H and I, буквы взяты из головы.
Х:                                      H:                                          I:                                      исходный (неспеццифичный) буффер:
Tris pH 7.5  10mM     HEPES pH8  20mM             Tris pH8      20mM                           1mM
glycerol 5%                                        20%                                        10%                              10%
EDTA  0.5mM                                     0.5mM                                   0.1mM                             -
MgCl2  1mM                                        5mM                                      -                                     1mM
DTT  0.5mM                                        1mM                                       0.1mM                         1mM
NaCl  100mM                                       -                                             50mM                              -
                                                                                                                                       ZnAc2   0.1mM
В реакцию добавлено 60fmole меченого ДНК, 4мкг ядерного экстракту и 2мкг poly(dIdC).

Результат: буфферы I и исходный связывают неспецифично и сильно, картинка загляденье. Буфферы Х и Н вроде бы дают специфичную картинку, но очень слабую, плохоотличимую от фона. Добавление BSA в количестве 20мкг убивает реакцию нафиг во всех случаях.

Кто возьмется проанализировать и сказать мне в какую сторону брести чтобы получить хороший шифт, на который еще и супершифт можно повесить?

Comments

[lenchu.livejournal.com]

В моей лабе есть товарищ, хорошо секущий в EMSA. Ну, и он вообще силен в биохимии. Хочешь, я спрошу его, может ли он помочь?

[murrka.livejournal.com]

ja s bol'shim udovol'stviem s nim poobschajus', spasibo

[lenchu.livejournal.com]

Я пошлю тебе его мейл в личку (он сейчас редко в лабе появляется - дописал докторат и доделывает статью, перед отъездом на постдок). И ему параллельно черкну пару слов о твоем вопросе. Зовут его Рони.