Химикам, биолухам, а особенно биохимикам

[murrka]

Проблема: неспецифичное связывание белка с отрезком ДНК.
Возможное решение: поменять буффер реакции (EMSA).
Из литературы выужено три буффера: X, H and I, буквы взяты из головы.
Х:                                      H:                                          I:                                      исходный (неспеццифичный) буффер:
Tris pH 7.5  10mM     HEPES pH8  20mM             Tris pH8      20mM                           1mM
glycerol 5%                                        20%                                        10%                              10%
EDTA  0.5mM                                     0.5mM                                   0.1mM                             -
MgCl2  1mM                                        5mM                                      -                                     1mM
DTT  0.5mM                                        1mM                                       0.1mM                         1mM
NaCl  100mM                                       -                                             50mM                              -
                                                                                                                                       ZnAc2   0.1mM
В реакцию добавлено 60fmole меченого ДНК, 4мкг ядерного экстракту и 2мкг poly(dIdC).

Результат: буфферы I и исходный связывают неспецифично и сильно, картинка загляденье. Буфферы Х и Н вроде бы дают специфичную картинку, но очень слабую, плохоотличимую от фона. Добавление BSA в количестве 20мкг убивает реакцию нафиг во всех случаях.

Кто возьмется проанализировать и сказать мне в какую сторону брести чтобы получить хороший шифт, на который еще и супершифт можно повесить?

Comments

[motek.livejournal.com]

Никогда не делала ЕМСУ, но как насчет ChIPа вместо этого? По-моему сейчас более популярно.

[murrka.livejournal.com]

для чипа нужно антитело хотя бы к одному белку из комплекса, у меня есть подозрения, но доказывается это ЕМСой и супершифтом. Иначе я буду калибровать до посинения этот чип...

[motek.livejournal.com]

А разве для супершифта не нужно антитело? И вообще для ЕМСы? Калибровать - как видишь Емсу тоже надо, и потом, по-моему, там больше неспецифики. В Чипе главное чтоб был позитив-контрол.

[murrka.livejournal.com]

для супершифта антитело надо, но после настройки шифта либо белок там есть и дает супершифт, либо его там нет. Когда у меня будет приличный шифт, я возьму днку за хвост и вытащу весь комплекс на масспек. Может, когда на реалтайм мне не надо будет записываться за неделю, я погоняю чипы. Сейчас мне надо шифты в статью.

[motek.livejournal.com]

Да, это ужасно, что на риал-тайм надо записываться за неделю (это в цабаме что ли? до сих пор?). Я только здесь приобщилась к риалтайму, тут даже никто и не думает гонять гели и даже что-то каллибровать, и так все работает всегда, просто удивительно (и у нас 2 машины в лабе, если заняты, то можно вечером поставить). У Итамара мы для чипа гоняли гели.

Смотри, чтобы ревьюеры статьи все-таки не потребовали еще и чип в итоге. Сегодня это гораздо больше котируется.

[murrka.livejournal.com]

не, они потребовали только супершифт, если вам несложно.

[lenchu.livejournal.com]

В моей лабе есть товарищ, хорошо секущий в EMSA. Ну, и он вообще силен в биохимии. Хочешь, я спрошу его, может ли он помочь?

[murrka.livejournal.com]

ja s bol'shim udovol'stviem s nim poobschajus', spasibo

[lenchu.livejournal.com]

Я пошлю тебе его мейл в личку (он сейчас редко в лабе появляется - дописал докторат и доделывает статью, перед отъездом на постдок). И ему параллельно черкну пару слов о твоем вопросе. Зовут его Рони.